徠卡冰凍切片機(jī)的技術(shù)操作

      徠卡冰凍超薄切片技術(shù)是使樣品迅速冷凍，然后用冷凍切片機(jī)進(jìn)行冷凍超薄切片。它省去了普通超簿切片法中繁雜的化學(xué)固定與包埋操作，在細(xì)胞化學(xué)研究中有著特殊的用途。為了很好保存形態(tài)結(jié)構(gòu)，必須使游離水形成玻璃態(tài)的冰，防止產(chǎn)生冰晶。這就要求很高的冰凍速率(~度/秒），這對于傳熱性能差的生物材料來說是困難的。一般除了盡可能地提高冷凍速率外，還可考慮采用盡可能小的樣品尺寸(小于1立方毫米)，對樣品進(jìn)行冷凍保護(hù)處理等，但通常也只能在樣品表面幾微米到幾十微米范圍內(nèi)能達(dá)到玻璃態(tài)。更深層將會因冷凍速率低而產(chǎn)生冰晶損傷。

下面是徠卡冷凍超薄切片法的主要步驟。

一、包裹

1、在一聚乙烯塑料管中加入牛血清白蛋白，貼A溶于0.1ml的磷酸緩沖液中，pH7．2，濃度為10％一20％；

2、符經(jīng)固定的組織塊表面的殘余液體月濾紙吸干，L一面振動塑料管，一面向其中逐滴加入25％的戊二醛，使管中戊二醛的zui終濃度為2．5％；

      L在上述條件下，徽約在半分鐘左右即可被戊二醛交連(聚合)，用保險(xiǎn)刀片將塑料管壁切除。把聚合的脅切成小方塊，使其大小賂大于包埋于其中的組織塊。如果樣品是游離細(xì)胞，可按下進(jìn)步驟包裹：

1、將帕A加入一離心管內(nèi)，濃度與上同；

2、把經(jīng)過固定的細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管；

3、在冷凍離心機(jī)上離心10分鐘，800B，40C；

4、去掉上清，在管底沉淀上加一滴用0．1m01／L磷酸緩沖液配制的10％的戊二醛。

5、用針把聚合后的團(tuán)塊撥起，切成小塊。

      為防止冷凍時(shí)生成大的冰晶而使結(jié)構(gòu)破壞，組織需經(jīng)冷凍保護(hù)劑處理，常用的冷凍保護(hù)劑有甘油和蔗糖，均用緩沖液配制，組織在冷凍保護(hù)劑中浸泡的時(shí)間為0.5—1J。

     為防止大的冰品產(chǎn)生，徠卡冰凍切片機(jī)除使用冷凍保護(hù)劑外，應(yīng)采取速凍的辦法，其基本要求與具體作法和冷凍斷裂與蝕刻時(shí)相同，即將經(jīng)冷凍保護(hù)的組織塊投入用液氮冷卻的氟里員12內(nèi)。

二、染色

      經(jīng)過固定和甘油或DM肋保護(hù)的組織，其冷凍超薄切片可以使用酷酸鈾和檸檬酸鉛染色。如果冷凍保護(hù)劑使用的是蔗糖，上述染色將會使結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞。

      對于徠卡冰凍切片機(jī)冷凍超薄切片，zui常使用的染色方法是負(fù)染。這時(shí)，可較正染法看到更多的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。負(fù)染的染液有鈞酸銨(2％，PH7．3)，醋酸鈾(0.5％，pH4．6)或酸性磷鎢酸(1％，pH6.7)染色時(shí)間為15—30秒，室溫。染后，用一濕的濾紙將多余染液吸

       以上所述的冷凍超薄切片制備法適用于形態(tài)，細(xì)胞化學(xué)或免疫標(biāo)記研究。制備過程中樣品要通過一系列的水溶性介質(zhì)，可稱為濕法。濕法會使樣品中的可溶性成份流失，因此不能用于這些成份的研究。為研究紹胞中的可擴(kuò)散的，水溶性成份，應(yīng)當(dāng)使用于法制備超薄切片。

       徠卡冰凍切片機(jī)冷凍干燥后的帶有切片的載網(wǎng)的氮?dú)?，并用棉花塞蓋緊。干切法得到的切片不能染色。常規(guī)電鏡樣品制備過程中，為保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)，樣品首先需要用化學(xué)固定劑固定。即使在冷凍超薄切片法中，為穩(wěn)定切片，樣品也需經(jīng)過固定。而任何化學(xué)固定劑都可能使生物大分子變性，從而存在著破壞細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)的潛在危險(xiǎn)。為避免這種可能，是*不用化學(xué)方法而改用物理方法固定組織。冷凍置換就是這樣一種方法。徠卡冰凍切片機(jī)的冷凍置換技術(shù)則是避免了化學(xué)固定的影響。

備注：徠卡冰凍切片機(jī)復(fù)型膜的分離與撈取的部分文章由北京中儀光科科技有限公司編輯整理上傳。