奧林巴斯生物顯微鏡——掃描電鏡標(biāo)本制備方法
奧林巴斯生物顯微鏡掃描電鍍是用來(lái)觀察樣品表面的結(jié)構(gòu)。二次電子象反映了樣品表面的形貌。因此對(duì)掃描電鏡標(biāo)本的*個(gè)要求是把待觀察的表面完整無(wú)損的暴露出來(lái)，固定好。
奧林巴斯生物顯微鏡與透射電鏡一樣，掃描電鏡標(biāo)本也是在真空中進(jìn)行觀察，因此必須干燥，而且干燥后樣品表面不變形。這是對(duì)樣品的第二個(gè)要求。生物樣品含水較多，干燥后容易皺紹。因此，在掃描電鏡標(biāo)本制備中有些特殊的干燥方法。
觀察時(shí)，電子束在樣品表面逐點(diǎn)掃描。一般情況下，入射電子數(shù)多于從樣品表面發(fā)出納電子數(shù)，因而便有電子在樣品上聚集，如標(biāo)本不導(dǎo)電，則聚集的電子將會(huì)放電產(chǎn)生干擾信號(hào)。生物組織多由低原子序數(shù)的碳、氫、氧、氮等元素組成，導(dǎo)電性差而電阻較高。因此，對(duì)掃描電鏡標(biāo)本的第三個(gè)要求是樣品導(dǎo)電。為此，又需做特殊的處理。
掃描電鎊觀察的表面一般是組織或器官的自然表面，如呼吸邏，消化道，泌尿及生殖管道的上皮表面。機(jī)體中分散細(xì)胞的自然表面以及骨胳等硬組織的自然面等。取材時(shí)，對(duì)于待觀察的部分要保護(hù)好，切勿用器械觸碰。如果上面粘有分泌物，粘濃或糞塊等污物，必須在固定前去除，以免遮蓋表面微紉結(jié)構(gòu)，清除的方法一般是用溫生理鹽水或緩沖液沖洗或噴射沖洗，硬組織可用超聲波（低頻）清洗。有的實(shí)驗(yàn)室用蛋白酶類清洗表面的粘液，但必須注意，蛋白酶不僅可除去表面粘附物，也可破壞樣品表面的蛋白質(zhì)。對(duì)于分散細(xì)胞表面的處理參見(jiàn)另一節(jié)。需特別提出的是，暴露出的表面需要清洗，但保存標(biāo)本的原則與透射電鏡標(biāo)本*相同；如動(dòng)物處死方法，取材速度及要求樣品中斷血液供應(yīng)后1—2分鐘內(nèi)進(jìn)入團(tuán)定液等。與透射電鏡標(biāo)本*不同的一點(diǎn)是樣品體積可大些。由子樣品臺(tái)較大，景深較深，掃描電鏡樣品塊可在10mm見(jiàn)方，5mm高的范圍。
電鍍標(biāo)本必須干燥。我們觀察樣品是觀察細(xì)胞表面的原貌，富有微細(xì)結(jié)構(gòu)的樣品表面往往經(jīng)過(guò)脫水及干燥后（特別是空氣中干燥后）發(fā)生嚴(yán)重變形。原因是液價(jià)（特別是水）的表面張力破壞了微紉結(jié)構(gòu)。雖然有些可揮發(fā)介質(zhì)如乙醇或丙圍的表面張力較小，但對(duì)類如氣管上皮表面纖毛這樣的細(xì)微結(jié)構(gòu)仍有損傷。因此，自掃描電鏡問(wèn)世后，雖然不少學(xué)者擬用于觀察生物樣品，就是因?yàn)檫^(guò)不好“干燥”這一關(guān)而未曾得到好的生物軟組織的掃描電鍍照片。自從1969年開(kāi)始使用臨界點(diǎn)于操法后，將掃描電鏡的生物樣品制備大大推進(jìn)了一步。目前世界上電鏡實(shí)驗(yàn)室多應(yīng)用臨界點(diǎn)干燥法與冷凍干燥法對(duì)掃描電鏡進(jìn)行干燥。
